求助大神:如何查找基因的保守或特异序列?谢谢
1、在页面左上角的方框里贴入基因序列，在下面的organism optional里面选择物种，点击最下面的BLAST按钮就行了。结果里面同源序列越多，就越保守。
2、全外显子测序（WES）是一种基因组学技术，专注于捕获和分析外显子区域的序列。外显子是DNA中编码蛋白质的部分，它们对基因的功能至关重要。这项技术通常采用两种方法：一种是使用基因芯片来捕获特定的外显子区域，另一种是通过设计特异性的引物进行PCR扩增。
3、SNP数量多，分布广泛。据估计，人类基因组中每1000个核苷酸就有一个SNP，人类30亿碱基中共有300万以上的SNPs。
CRISPR/Cas9实验设计方法
匹配度：sgRNA序列与靶位点的匹配数应尽可能高，一般大于60认为是可用的。转录效率：如果构建U6启动子或T7启动子驱动的sgRNA表达载体，需考虑sgRNA的5碱基为G或GG以提高转录效率。选择和设计Cas9蛋白：根据实验需求选择合适的Cas9蛋白变体，如SpCasSaCas9等。
sgRNA设计流程包括以下原则： sgRNA长度：SpCas9一般为20nt。 sgRNA序列碱基组成：基因特异的sgRNA模板序列位于PAM序列前，PAM序列特征为NGG （N为任意核苷酸），选择3末端含有GG的sgRNA，可构成PAM序列。sgRNA序列应避免以4个以上的T结尾，GC含量最佳为30%-70%（40%-60%）。
选择载体，点击Next，设置保存位置，完成Assemble步骤。最后，针对选定的靶点，获取FWD和REV引物序列，退火后连接到载体上即可。一般情况下，针对一个靶基因设计4-5条sgRNA，从中筛选出活性较高的1-2条进行后续实验。此步骤对CRISPR/Cas9实验的成功至关重要，确保了基因编辑的精确性和效率。
登录设计工具网站，创建sgRNA文件，并导入目标基因的DNA序列。选择合适的位置进行设计。获得多个靶点设计后，选择评分较高的靶点进行保存或导出。若需构建载体，则选择靶点并点击Assemble，选择载体并完成相关设置。获取FWD和REV引物序列，退火后连接到载体上。
什么叫做热点
在网页设计中：热点指的是网页中相关关键词内嵌的链接。这些链接通常用于引导用户访问网页内的其他部分或相关资源。在通信领域：热点是指通过高速线路将因特网接入人员密集场所的现象。在这些地区，由于发射出的电波能够覆盖到较大范围，携带支持无线LAN的设备的用户可以进入该区域并高速接入因特网。
热点，英文为 hot spot，有以下4个含义：网页中的相关关键词内嵌的链接，也叫做热点。通过高速线路将因特网接入人员较密集的场所，由于该地区所发射出的电波可以达到距接入点半径数十米至100米的地方，用户只要将支持无线LAN的笔记本电脑或PDA拿到该区域内，即可高速接入因特网。
热点，英文为 hot spot，拥有五种含义。首先，网页中的相关关键词内嵌的链接亦称为热点。其次，通过高速线路将因特网接入人员密集场所的现象，称作热点。在此类地区，因发射出的电波能够覆盖到半径数十至一百米的范围，携带支持无线LAN的设备，如笔记本电脑或PDA，进入该区域即可高速接入因特网。
手机wlan热点的意思就是说将你自己的手机作为一个热点，类似于Wifi一样的东西，别人可以通过密码连接你的手机，使用你的流量。所以一定要谨慎使用。设置热点，首先打开手机的设置。找到自己的个人热点，点进去。打开wlan热点，在点击配置wlan热点。
个人热点是指通过手机等移动设备创建的无线局域网热点。开启个人热点功能后，设备能将自身的移动网络信号转化为Wi-Fi信号，可供其他设备如笔记本电脑、平板电脑等连接使用。创建个人热点的设备就如同一个小型的无线路由器。
指的是比较受广大群众关注，或者欢迎的新闻或者信息，或指某时期引人注目的地方或问题。如“社会热点”、“绵山成为旅游的热点”等。热点 解释；指某时期引人注目的地方或问题：古都西安成为旅游的～。近义词；热门 拼音；[ rè mén ]解释；吸引人的、受欢迎的食物：～话题。
简单5步设计qPCR引物
Step2：引物基本参数设置 这一部分开头有两个使用自己的序列选项，当我们使用其他工具设计的引物时填写，这里空着即可。接下来可以填写产物的大小，一般50~300之间都可行，我通常使用70~200的范围。Step3：外显子/内含子设置 如果在Step1中提交的是FASTA文件，则无法进行外显子/内含子设置，因为只有在NCBI数据库内的序列，才能确定外显子/内含子位置。
qPCR引物设计的流程主要包括以下步骤：获取目标基因的CDS序列：在NCBI等数据库中搜索并下载目标基因的CDS序列。这是转录产物mRNA的直接模板，确保引物能有效扩增mRNA，而非包含内含子的全长序列。确定引物设计原则：引物长度应控制在1824个核苷酸之间。Tm值需适中，以保证引物与目标序列的特异性结合。
qPCR基于PCR技术，利用荧光信号的积累来定量特定DNA片段的拷贝数，从而推算基因转录表达量。确定扩增序列：明确需要扩增的DNA序列，这是设计引物的基础。选择设计区域：优先选择基因的CDS来设计引物，因为CDS是唯一能够编码蛋白质的序列，可以提高扩增的特异性。
步骤一：使用参考文献提供的序列。若已有相关文献，可以直接引用文献中的 ChIP-qPCR 引物序列，这通常已通过验证。步骤二：查阅 ChIP-Seq 数据。Shirley Liu Lab 推出的 Cistrome Data Browser 收集了大量 ChIP-Seq 数据，通过筛选高质量数据，可以为设计引物提供可靠的依据。
CHOPCHOP网页版设计细菌的sgRNA
1、CHOPCHOP网页版是一款用于设计细菌的sgRNA的工具。在使用CHOPCHOP设计sgRNA时，首先需要确定目标位点。目标位点可以是基因名称，也可以是基因序列。在确定了目标位点之后，用户可以点击“Find Target Sites”按钮，CHOPCHOP将自动搜索该位点的潜在切割位点。
2、需要。虽然chopchop可以帮助用户搜寻候选的sgRNA，并显示在全基因组范围内潜在的脱靶位点，但是为了确保sgRNA的有效性和安全性，仍需要进行结构检测，结构检测可以确保sgRNA的稳定性和活性，同时避免潜在的脱靶效应。
3、然后，选择合适的sgRNA设计网站，如Cas-Designer或CRISPOR。输入序列信息，选择正确的物种和Cas9蛋白。网站会生成sgRNA序列信息，包括序列、PAM、特异性评分、切割效率评分和潜在的脱靶位点。此外，CHOPCHOP和E-CRISP也是设计sgRNA和预测脱靶的工具。每个网站的评分规则不同，设计时需综合考虑。
4、选取上图中序列作为sgRNA的靶序列，在sgRNA设计网站输入靶基因信息和设计相关信息。常用的sgRNA设计网站包括CRISPOR、GPP Web Portal、E-CRISP、CHOPCHOP等。此处选择CRISPOR进行sgRNA设计，输入靶序列，选定基因对应的物种信息和Cas9和PAM种类后点击提交，得到sgRNA序列和相关信息。
